حد تشخیص LOD و حد تعیین کمی LOQ

مشاوره پیاده سازی استانداردISO 17025:2017

1 حد تشخیص و حد تعیین کمی

حد تشخیص و حد تعیین کمی

اصطلاح ها و تعاریف

جایی که اندازه گیري ها در غلظت هاي پایین انجام می شوند، سه مفهوم کلی را می بایست در نظر گرفت. اولاً، ممکن است ایجاد مقداري از نتیجه که نشان دهد آن مقدار آنالیت به طور قابل ملاحظه اي متفاوت از صفر است، ضروري باشد. اغلب در این سطح لازم است تا اقداماتی نظیر بیان یک ماده آلوده نیز انجام شود. این سطح، «مقدار بحرانی»، «حد تصمیم» یا در رهنمودهاي اتحادیه اروپا، «CCα «نامیده می شود. ثانیاً، دانستن پایین ترین غلظت آنالیت که بتواند در سطح مشخص اطمینان توسط متد شناسایی شود نیز مهم است. بدین معنا که در چه غلظت واقعی ما با اطمینان می توانیم بگوییم که از مقدار بحرانی توصیف شده در بالا تجاوز خواهیم کرد؟ اصطلاح هایی نظیر «حد تشخیص» (LOD) «حداقل مقدار قابل تشخیص» یا در رهنمودهاي اتحادیه اروپا CCB براي این مفهوم استفاده می شود. ثالثاً، تعیین کمترین سطحی که در آن سطح، عملکرد متد براي یک کاربرد نوعی قابل قبول است نیز مهم می باشد. مفهوم سوم معمولاً به نام «حد تعیین کمی» (LOQ) شناخته می شود.

واژه هاي مرتبط با این مفاهیم بسیار متنوع بوده و در بخش هاي مختلف نیز متفاوت می باشند. براي مثال، اصطلاح «حد تشخیص» (LOD) گرچه در گذشته به طور عمومی پذیرفته نشده بود، با این حال در بعضی از اسناد بخشی مورد استفاده قرار می گرفت. هر چند که این واژه ها در حال حاضر در VIM و کتاب طلایی آیوپاك گنجانده شده اند. ISO به عنوان اصطلاح عمومی از اصطلاح «حداقل مقدار قابل تشخیص متغیر حالت نهایی» استفاده می کند که ترجمه ي آن به زبان شیمی، «حداقل غلظت نهایی قابل تشخیص» خواهد شد. در این راهنما، اصطلاح هاي «مقدار بحرانی»، «حد تشخیص» (LOD) و «حد تعیین کمی» (LOQ) براي سه مفهوم بالا به کار می روند. LOD و LOQ به طور متداول در صحه گذاري متد تعیین می شوند. تمایز گذاري بین حد تشخیص دستگاه و حد تشخیص متد نیز ضروري است. حد تشخیص دستگاه می تواند بر پایه آنالیز یک نمونه پایه گذاري شود که اغلب واکنشگر بلانکی است که به طور مستقیم (یعنی هرگونه مراحل تهیه نمونه در آن حذف شده) یا به صورت نسبت سیگنال به نویز، براي مثال یک کروماتوگرام به دستگاه معرفی می شود. جهت دستیابی به حد تشخیص متد، LOD می بایست بر اساس آنالیز نمونه هایی که تمام مراحل روش اجرایی اندازه گیري را پشت سر گذاشته اند و استفاده از نتایج محاسبه شده با معادله یکسان براي نمونه هاي آزمایشی، پایه گذاري شود. این روش حد تشخیص، مفیدترین روش صحه گذاري متد بوده و بنابراین تمرکز این راهنما نیز بر آن است. پاراگراف هاي بعدي، تخمین آزمایشی LOD و LOQ را توصیف می کنند. از آنجا که LOD و LOQ به میزان دقت در صفر یا نزدیک صفر بستگی دارند، لذا ابتدا تخمین آزمایشی انحراف استاندارد نتایج نزدیک به صفر را توصیف می کند.

تعیین انحراف استاندارد در سطوح پایین

LOD و LOQ ،معمولا با ضرب انحراف استاندارد (s0) در یک فاکتور مناسب محاسبه می شوند. مهم است که این انحراف استاندارد، نماینده دقت به دست آمده براي نمونه هاي آزمایشی نوعی باشد و اندازه گیري هاي تکراري کافی نیز جهت ارائه تخمین مناسب در آن لحاظ شده باشند. در این بخش، انحراف استاندارد s0 بر اساس انحراف استاندارد s0 براي نتایج تک نزدیک صفر پایه گذاري شده است که در عمل براي هر گونه معدل گیري یا تصحیح بلانک نیز تنظیم می شود. (پایین را ببینید)

مواردي که در ادامه می آیند، می بایست در تعیین LOD و LOQ یک آزمایش با استفاده از تکرار ساده لحاظ شوند.

نمونه هاي مناسب براي تخمین LOD و LOQ :نمونه هاي استفاده شده می بایست ترجیحاً یا a (نمونه هاي بلانک، یعنی ماتریکس هایی که شامل آنالیت غیرقابل تشخیص هستند و یا b (نمونه هاي آزمایشی با غلظت هاي آنالیت نزدیک به LOD و یا زیر LOD مورد انتظار باشند. نمونه هاي بلانک براي متدهایی که در آنها یک سیگنال قابل اندازه گیري براي یک بلانک به دست می آید، مثل اسپکتروفتومتري و اسپکتروسکوپی اتمی مناسب می باشند.

با این حال، براي تکنیک هایی نظیر کروماتوگرافی که مبتنی بر تشخیص پیک بالاي نویز می باشد، نمونه هایی با سطوح غلظت نزدیک LOD یا بالاي LOD نیاز می باشند. این نمونه ها را می توان براي مثال با، نشانه گذاري یک نمونه بلانک تهیه کرد.

وقتی نمونه هاي بلانک یا نمونه هاي آزمایشی در غلظت هاي پایین در دسترس نباشند، اغلب بلانک هاي واکنشگر استفاده می شوند. چنانچه این بلانک هاي واکنشگر کل روش اجرایی اندازه گیري را پشت سر نگذاشته و به طور مستقیم به دستگاه معرفی شوند، محاسبه انجام شده بر پایه این اندازه گیري ها LOD/LOQ دستگاه را ارائه خواهد داد.

پوشش دهی دامنه ي کاربرد متد: براي متدهاي با دامنه پوششی ماتریکس هاي بسیار متفاوت، ممکن است تعیین انحراف استاندارد هر ماتریکس به طور جداگانه الزامی باشد.

تضمین تکرار نمایندگی: انحراف استاندارد می بایست نماینده عملکرد متد، به همان شکلی باشد که در آزمایشگاه استفاده می شود، یعنی انحراف استاندارد می بایست بر اساس نتایج آزمایشی محاسبه شود که در آن ها، آنالیزها دقیقاً مطابق با روش اجرایی اندازه گیري مستند شامل تمام مراحل تهیه نمونه انجام شده باشند. مقادیر استفاده شده براي محاسبه انحراف استاندارد s0 می بایست مطابق با واحدهاي اندازه گیري مشخص در روش اجرایی باشند.

شرایط اندازه گیري: معمولا انحراف استاندارد تحت شرایط تکرارپذیري به دست می آید و این روش در این بخش توضیح داده می شود. با این حال، تخمین قابل اعتمادتر می تواند با استفاده از شرایط دقت میانی به دست آید.

تعداد مشاهدات: تعداد تکرارها (m ) جهت دستیابی به تخمین رضایت بخش از انحراف استاندارد می بایست کافی باشند. نوعاً بین 6 تا 15 تکرار لازم است. اغلب در روش هاي اجرایی/ پروتوکل هاي صحه گذاري 10 تکرار پیشنهاد می شود.

محاسبه معدل گیري: در بسیاري از روش هاي اندازه گیري، میانگین تکرارها در استفاده روتین متد گزارش می شود. در اینجا هر تکرار با اجراي کل روش اندازه گیري به دست می آید. در این حالت، انحراف استاندارد نتایج تک s0 می بایست با تقسیم بر ریشه ي دوم n ،تصحیح شود. در اینجا n ،تعداد تکرارهاي معدل گیري شده در استفاده روتین می باشد.

محاسبه اثر تصحیح هاي بلانک: اگر تصحیح هاي بلانک در روش اندازه گیري مشخص شده باشند، آنگاه می بایست در تعیین انحراف استاندارد براي محاسبه LOD یا LOQ احتیاط شود. اگر در مطالعه صحه گذاري، تمام نتایج با مقدار بلانک یکسان تصحیح شده به دست آیند ـ رویکردي که در اینجا براي سادگی ارائه شده ـ آنگاه انحراف استاندارد نتایج در مقایسه با زمانی که در عمل، نتایج با مقادیر بلانک تصحیح شده متفاوت در اجراهاي مختلف به دست می آیند، کوچکتر خواهد بود.

در این مورد، so می بایست با ضرب در مقدار

تصحیح شود. در اینجا n ،تعداد مشاهدات تکراري معدل گیري شده هنگام گزارش نتایج است، وقتی که هر تکرار با دنبال کردن کل روش اندازه گیري به دست آید و nb تعداد مشاهدات بلانک استفاده شده براي محاسبه تصحیح بلانک می باشد. توجه داشته باشید که تحت شرایط دقت میانی، نتایج، با مقادیر بلانک متفاوت تصحیح خواهند شد، لذا هیچ تصحیحی براي انحراف استاندارد لازم نمی باشد.

مثال 3 ،این محاسبات را نشان داده و فلوچارت شکل 2 نیز تصحیح هاي لازم براي معدل گیري و تصحیح بلانک را خلاصه می کند.

so: انحراف استاندارد تخمینی، m نتیجه تک در غلظت صفر و یا نزدیک به غلظت صفر

so: انحراف استاندارد استفاده شده براي محاسبه LOD و LOQ

n : تعداد مشاهدات تکراري معدل گیري شده هنگام نتایج گزارش، که در آن هر تکرار با دنبال کردن کل روش اندازه گیري به دست می آید.

nb: تعداد مشاهدات بلانک معدل گیري شده هنگامی که تصحیح بلانک طبق روش اندازه گیري محاسبه می شود.

شکل 2 .محاسبه انحراف استاندارد، so که می بایست براي تخمین LOD و LOQ استفاده شود. فلوچارت با انحراف استاندارد آزمایشی، so شروع شده که تحت شرایط تکرارپذیري از نتایج اندازه گیري هاي تکراري روي نمونه نزدیک به غلظت صفر، محاسبه می شود. در اینجا یا تصحیح بلانک انجام نشده و یا تصحیح بلانک براي تمام نتایج مشخص شده در متد اعمال خواهد شد. تصحیح بلانک ممکن است بر اساس یک مشاهده بلانک تک یا بر اساس میانگین چندین مشاهده بلانک پایه گذاري شده باشد.

تخمین LOD

براي اهداف صحه گذاري، معمولا بیان مقدار تقریبی LOD ، یعنی سطحی که در آن تشخیص آنالیت مشکل ساز می شود، کافی است. بدین منظور رویکرد 3s نشان داده شده در مرجع خلاصه 2 معمولاً کافی خواهد بود.

وقتی که بحث تایید نظارتی یا انطباق با یک ویژگی مطرح باشد، به خصوص در محاسبه درجات آزادي مرتبط با so به رویکرد دقیق تري نیاز می باشد. این رویکرد به طور کامل توسط آیوپاك و دیگر منابع توصیف شده است. جایی که مقدار بحرانی و/ یا LOD براي تصمیم گیري استفاده شوند، دقت می بایست پایش شده و هر وقت که لازم باشد حدود نیز می بایست مجددا محاسبه شوند. بخشها و مقررات مختلف ممکن است از رویکردهاي مختلف براي تخمین LOD استفاده کنند. پیشنهاد می شود که قرارداد استفاده شده هنگام گزارش حد تشخیص بیان شود. در غیاب هر گونه راهنماي سازمانی در مورد تخمین LOD ،رویکردهاي ارائه شده در مرجع خلاصه 2 می توانند به عنوان راهنماي عمومی مورد استفاده قرار گیرند.

تخمین LOQ

LOQ پایین ترین سطح آنالیت است که می تواند با عملکرد قابل قبول تعیین شود («عملکرد قابل قبول» به اشکال مختلف، در راهنماهاي مختلف، شامل دقت، دقت و درستی یا عدم قطعیت اندازهگیري میباشد .با این حال، در عمل، LOQ در بیشتر قراردادها به صورت غلظت آنالیت مطابق با انحراف استاندارد به دست آمده so در سطوح پایین با ضرب در فاکتور kQ ،محاسبه می شود. مقدار پیش فرض آیوپاك براي kQ ،رقم 10 است و اگر انحراف استاندارد به طور تقریبی در غلظت هاي پایین ثابت باشد، این ضریب با انحراف استاندارد نسبی (RSD%) برابر خواهد شد. ضرایب 5 و 6 نیز بعضی اوقات استفاده شده که به ترتیب با مقادیر %20 و%17 متناظر می باشند. در این رابطه مرجع خلاصه 3 و دیگر مراجع را مشاهده کنید.

روش هاي اجرایی جایگزین

بخش هاي قبلی، رویکرد عمومی تخمین LOD و LOQ را بر اساس انحراف استاندارد نتایج در غلظت هاي نزدیک صفر توصیف می کنند که تحت شرایط تکرارپذیري به دست آمده اند. اگر چه این رویکرد به طور گسترده به کار می رود، اما روش هاي اجرایی جایگزین دیگري نیز در استانداردها و پروتوکل ها مشاهده می شوند.

در بعضی موارد، براي مثال جایی که مقادیر بلانک به طور چشمگیر از روزي به روز دیگر تغییر می کنند، شرایط دقت میانی به شرایط تکرارپذیري ترجیح داده می شوند. براي مثال، چنانچه نتایج کنترل کیفیت براي نمونه هاي آزمایشی در سطوح غلظت پایین در دسترس باشند، انحراف استاندارد این نتایج می تواند در تخمین LOD و LOQ مورد استفاده قرار گیرد. جایی که انحراف استاندارد استفاده شده براي محاسبه LOD و LOQ تحت شرایط دقت میانی به دست آمده باشد، دیگر نیازي به تصحیح بلانک نشان داده شده در شکل 2 ،نمی باشد. بنابراین انحراف استاندارد آزمایشی به دست آمده از کنترل کیفیت داخلی برابر با انحراف استاندارد so می باشد که براي محاسبه LOD و LOQ استفاده خواهد شد. ISO ،2-11843 توضیح می دهد که چطور LOD دستگاه می تواند به طور مستقیم از منحنی کالیبراسیون به دست آید.

قابلیت اطمینان تخمین های LOQ و LOD

می بایست به این نکته توجه شود که حتی با 10 تکرار اشاره شده در مرجع خلاصه 2 و مرجع خلاصه 3 ،تخمین هاي انحراف استاندارد ذاتا متغیر هستند. بنابراین، تخمین LOQ/LOD به دست آمده هنگام صحه گذاري می بایست به عنوان یک مقدار شاخص در نظر گرفته شود. با این حال، اگر تخمینی از LOQ/LOD لازم باشد که خیلی ساده نشان دهنده غلظت هاي نمونه هایی باشد که بالاي LOQ/LOD قرار می گیرند، این تخمین کافی خواهد بود. جایی که انتظار میرود نمونه هاي آزمایشگاهی شامل غلظت هاي پایین آنالیت باشند، LOQ/LOD نیز می بایست به صورت منظم پایش شوند.

توانایی تشخیص آنالیز کیفی

آنالیز کیفی، شامل شناسایی یا طبقه بندي مواد است که در یک غلظت جدایِش (برِش) از آنالیت، به طور مؤثر به پاسخ «آري» یا «خیر» منجر خواهد شد. براي متدهاي کیفی، دقت برحسب انحراف استاندارد یا انحراف استاندارد نسبی بیان نشده و به جاي آن از شکل نرخ هاي مثبت و منفی درست و غلط استفاده می شود.

غلظت جدایش در مطالعه صحه گذاري، با تعریف نرخ هاي مثبت و منفی غلط در تعدادي از سطوح بالا و پایین غلظت جدایش مورد انتظار تعیین می شود. حد جدایش جایی است که نرخ هاي منفی غلط براي غلظت هاي بالاي حد (براي مثال با احتمال بیان شده، %5 ،(پایین می باشند. در صحه گذاري، حد جدایش پیشنهادي در روش اجرایی مستند، ارزیابی می شود.