در شیمی تجزیه، غلظت محلول نمونه ناشناخته را می توان با استفاده از منحنی کالیبراسیون بدست آورد. این یک نمودار تجربی است که غلظت محلول در محور x و قابل مشاهده در محور y رسم شده است . منحنی های کالیبراسیون در درجه اول برای تعیین غلظت یک نمونه ناشناخته استفاده می شود. محلول های استاندارد با خواص مشابه نمونه مورد اندازه گیری ایجاد شده و جذب آنها در اینجا اندازه گیری می شود. از آنجایی که غلظت محلول های استاندارد مشخص است، جذب اندازه گیری شده را می توان در مقابل آن رسم کرد.

منحنی کالیبراسیون HPLC:

درباره HPLC:

مخفف HPLC مخفف High Performance Liquid Chromatography می باشد. “کروماتوگرافی” یک فرآیند جداسازی است، “کروماتوگرام” خروجی جداسازی است و “کروماتوگرافی” وسیله ای است که برای انجام کروماتوگرافی استفاده می شود.
در میان فناوری‌های مختلف ایجاد شده برای کروماتوگرافی، ستون‌ها و پمپ‌های با کارایی بالا برای تامین حلال با دبی ثابت از مهم‌ترین اجزای کروماتوگرافی هستند. با پیشرفته‌تر شدن فناوری‌های مرتبط، سیستمی که قبلاً به عنوان کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا شناخته می‌شد به «LC» کوتاه شد . کروماتوگرافی مایع با کارایی بسیار بالا (UHPLC) که قادر به تجزیه و تحلیل با سرعت بالا است نیز در سال های اخیر محبوبیت زیادی پیدا کرده است.

از HPLC فقط می توان برای بررسی مواد محلول در حلال ها استفاده کرد. HPLC مواد محلول در یک نمونه مایع را جدا می کند و امکان بررسی کیفی و کمی اجزای نمونه و غلظت آنها را فراهم می کند.

یک منحنی کالیبراسیون برای تعیین غلظت آنالیت ها در نمونه مورد نیاز است.

منحنی کالیبراسیون نمونه با مقادیر غلظت در محور x و سطح زیر منحنی در محور y. 

بسیاری از غلظت ها برای ایجاد یک خط خطی اندازه گیری می شوند که منحنی کالیبراسیون است. این غلظت ها هم غلظت کمتر و هم بیشتر از غلظت مورد انتظار آنالیت در نمونه واقعی دارند. هنگامی که غلظت آنالیت در نمونه واقعی ناشناخته است، معمول است که یک منحنی کالیبراسیون با استفاده از حداقل هشت غلظت نمونه مختلف ایجاد شود. از آنجایی که غلظت مورد انتظار آنالیت در نمونه واقعی مشخص است، می توان تعداد غلظت های نمونه مورد نیاز برای منحنی کالیبراسیون را کاهش داد.

نحوه تهیه منحنی کالیبراسیون HPLC:

روش های HPLC به منظور تولید یافته های کمی نیاز به کالیبراسیون دارند. کالیبراسیون HPLC انواع مختلفی دارد که هر کدام مزایا و معایب خاص خود را دارند. هدف این است که بهترین را انتخاب کنید و از بسیاری از اشتباهات جزئی در طول مسیر اجتناب کنید، زیرا هیچ کس یک راه حل تقریبا کامل نمی خواهد.

1. مرحله 1: در مورد عواملی که ممکن است در نمونه شما وجود داشته باشد، چند فرض اولیه و کیفی ایجاد کنید. بیایید وانمود کنیم که قندهای گلوکز، گالاکتوز و هیدروکسی متیل فورفورال (HMF) در نمونه شما وجود دارد.
2. مرحله 2: یک راه حل مرجع ارائه کنید که همه بخش ها را، هم به طور کلی و هم به صورت جداگانه، در بر می گیرد. یک محلول ذخیره 6 گرم در لیتر که گلوکز، گالاکتوز و HMF را ترکیب می کند می تواند برای تولید پنج محلول استاندارد مختلف از طریق رقت سازی سریال استفاده شود. از غلظت های 6 گرم در لیتر گلوکز، 6 گرم در لیتر گالاکتوز و 6 گرم در لیتر HMF برای اجزای جداگانه استفاده کنید. این روش زمان نگهداری (زمان لازم برای خروج از ستون) هر جزء در نمونه را نشان می دهد.
3. مرحله 3: سوم، تمام محلول های استاندارد را با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) تجزیه و تحلیل کنید و سطح پیک و زمان ماند برای هر جزء را یادداشت کنید.
4. مرحله 4: منحنی کالیبراسیون (گراف)، که نمودار مساحت پیک در مقابل غلظت است، در اکسل یا برنامه مناسب دیگری ایجاد کنید. یک خط مستقیم ایجاد کنید که به بهترین وجه با داده های شما در نمودار شما مطابقت داشته باشد. اطمینان حاصل کنید که ضریب تعیین یا همبستگی بسیار نزدیک به 1 است.
5. مرحله 5: پنجم، نمونه خود را با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) تجزیه و تحلیل کنید و ناحیه پیک و مدت زمان ماندگاری را یادداشت کنید. سپس غلظت هر جزء در نمونه شما را می توان با استفاده از منحنی کالیبراسیون که در مرحله 4 ایجاد کردید محاسبه کرد.